Grzyby zasiedlające środowisko glebowe ziemniaka z uwzględnieniem potencjalnej mykotoksynotwórczości rodzaju Fusarium

 

 

Uniwersytet Technologiczno-Przyrodniczy w Bydgoszczy, Katedra Fitopatologii

 

Dr inż. Leszek Lenc

 

        

         Skład zbiorowisk mikroorganizmów glebowych ma ogromne znaczenie w rolnictwie ekologicznym, gdzie ograniczanie występowania szkodliwych drobnoustrojów jest szczególnie trudne. Poznanie zależności pomiędzy mikroorganizmami oraz stwarzanie sprzyjających warunków do rozwoju gatunków saprotroficznych, może wpływać na zmniejszenie liczebności czynników chorobotwórczych.

          Materiał do analiz pobierano fazie wschodów i fazie kwitnienia z pól doświadczalnych IUNG – PIB w Osinach, spod ziemniaka odmiany Drop uprawianego w systemie ekologicznym i integrowanym.

          Izolację grzybów wykonano z gleby pozaryzosferowej (metodą piaskową Warcupa) z ryzosfery i ryzoplany (metodą 10-krotnych rozcieńczeń) oraz z korzeni (wykładając na pożywkę PDA po 180 skrawków dokładnie opłukanych korzeni). Ogółem wyizolowano ponad 11.000 grzybów należących do 91 gatunków reprezentujących 55 rodzajów oraz grzybnie niezarodnikujące (tab.1).

Tab. 1

Liczba ogólnej populacji grzybów wyizolowanych spod uprawy ziemniaka,
Osiny 2005-2007

Frakcja/ system uprawy

Faza rozwojowa

Wschody

Kwitnienie

Razem

Gleba pozaryzosferowa

E*

875

1107

1982

I

866

1180

2046

Razem

1741

2287

4028

Ryzosfera

E

1091

620

1711

I

1071

741

1812

Razem

2162

1361

3523

Ryzoplana

E

425

784

1209

I

615

674

1289

Razem

1040

1458

2498

Korzenie

E

191

281

472

I

232

253

485

Razem

432

534

957

   */E – system ekologiczny,             I – system integrowany

 

Wyodrębnione grzyby podzielono na cztery grupy:

Ø potencjalnie patogeniczne (rodzaje: Fusarium, Rhizoctonia, Alternaria, Colletotrichum, Phoma)

Ø antagonistyczne (Trichoderma spp., Gliocladium spp.)

Ø grzyby rodzaju Penicillium

Ø pozostałe określone jako „inne”

 

Analiza mykologiczna wykazała, że we wszystkich badanych frakcjach, zarówno w fazie wschodów jak i fazie kwitnienia, udział procentowy grzybów potencjalnie patogenicznych był wyższy w ekologicznym aniżeli w integrowanym systemie uprawy (rys.1).

 

Rys. 1. Procentowy udział poszczególnych grup grzybów w glebie pozaryzosferowej, ryzosferze i ryzoplanie ziemniaka, Osiny 2005-2007

 

 

          W uprawie ziemniaka z grzybów glebowych dużym zagrożeniem są Rhizoctonia solani i grzyby rodzaju Fusarium. R. solani powodując zgniliznę kiełków i próchnienie podstawy łodyg znacznie zmniejsza plon, a występujące na bulwach sklerocja obniżają ich jakość. Szkodliwość grzybów rodzaju Fusarium polega nie tylko na zmniejszaniu plonu
i pogorszeniu jakości, ale także na wytwarzaniu toksycznych dla ludzi, zwierząt i roślin metabolitów wtórnych (mykotoksyn).

          Badania polowe przeprowadzono w latach 2005–2007 na doświadczeniu założonym przez IHAR Oddział w Jadwisinie, na polach doświadczalnych IUNG – PIB w Osinach k/Puław. Objawy w/w chorób określano na 8 odmianach ziemniaka (Orlik, Drop, Gracja, Korona, Bartek, Triada, Syrena, Zeus) uprawianego w systemie ekologicznym i integrowanym. W czasie wschodów określano występowanie zgnilizny kiełków (R. solani). W każdym roku oceniono kiełki wyrosłe z 2.400 sadzeniaków (łącznie 7.200).

Cztery tygodnie po zbiorze, makroskopowo określano występowanie ospowatości (R. solani) i suchej zgnilizny (Fusarium spp.) bulw ziemniaka. W każdym roku oceniono 9.600 bulw (łącznie 28.800).

Badania wykazały, że istotnie więcej zgnilizny kiełków obserwowano w ekologicznym systemie uprawy, natomiast objawy ospowatości bulw i suchej zgnilizny bulw ziemniaka w obu systemach uprawy były na tym samym poziomie (rys. 2, 3 i 4).

 

Rys. 2 Wpływ systemu uprawy na występowanie zgnilizny kiełków (R. solani)

 

Rys. 3 Wpływ systemu uprawy na występowanie ospowatości bulw (R. solani)

 

Rys. 4 Wpływ systemu uprawy na występowanie suchej zgnilizny bulw (Fusarium spp.)

 

Rys. 5 Wpływ systemu uprawy na wysokość plonu ziemniaka

 

 

 

 

Badania molekularne

 

          Wyizolowane w trakcie trwania badań i doprowadzone do kultur jednozarodnikowych (Fusarium sambucinum i F. solani) oraz jednostrzępkowych (Rhizoctonia solani) izolaty, poddano badaniom molekularnym. Przy użyciu specyficznych starterów typu SCAR, stosując łańcuchową reakcję polimerazy (PCR), potwierdzano przynależność gatunkową grzybów i określano ich potencjalną mykotoksynotwórczość (F. sambucinum i F. solani) oraz grupy anastomozowe (R. solani).

          Test wykonany na izolatach Rhizoctonia, pochodzących z bulw i kiełków ziemniaka uprawianego w różnych rejonach Polski (lubelskie, kujawsko-pomorskie, wielkopolskie, mazowieckie, pomorskie) oraz 1 z Norwegii, wykazał obecność oczekiwanego produktu amplifikacji (o długości 550 pz) w 97,6% próbach, potwierdzając ich przynależność do R. solani (fot. 1).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                   Fot. 1. Potwierdzenie przynależności gatunkowej R. solani metodą PCR

 

 

 

          Przeprowadzona reakcja PCR na przynależność R. solani do grup anastomozowych wykazała, że na 94,2% z nich należało do AG 3 najbardziej patogenicznej dla ziemniaka grupy anastomozowej (fot. 2).

 

 

 

 

Fot. 2. Molekularna analiza przynależności izolatów R. solani do grupy anastomozowej AG 3

Przeprowadzona reakcja PCR dla izolatów F. sambucinum wykazała obecność oczekiwanego produktu amplifikacji (o długości 315 pz) w 90% izolatów, potwierdzając ich przynależność do tego gatunku (fot. 3).

 

 

 

Fot. 3. Potwierdzenie przynależności gatunkowej F. sambucinum metodą PCR

 

 

 

 

 

 

 

 

Badania potencjalnej zdolności tworzenia trichotecenów przez F. sambucinum przeprowadzone zostały na uprzednio zweryfikowanych izolatach. We wszystkich przypadkach uzyskano pozytywny wynik na obecność genu Tri 5, warunkującego zdolność do syntezy tych mykotoksyn (fot. 4)

 

 

 

 

 

Fot. 4. Molekularna analiza potencjalnej zdolności tworzenia trichotecenów przez
F. sambucinum

 

Nie stwierdzono potencjalnej zdolności do syntezy trichotecenów przez F. solani. Badania prowadzono na izolatach pochodzących z bulw ziemniaka uprawianego w różnych rejonach kraju.

 

Dalsze analizy dotyczyły możliwości tworzenia przez F. sambucinum trichotecenów z grupy B (DON i NIV). Z żadnego izolatu nie uzyskano oczekiwanego produktu amplifikacji (o długości 282 pz dla deoksyniwalenolu i 312 pz dla niwalenolu), który wskazywałby na potencjalną możliwość tworzenia tych mykotoksyn.

 

Analiza potencjalnej zdolności F. sambucinum do syntezy eniatyn wykazała, że w 91% izolatów uzyskano produkt długości 332 pz, co jednoznacznie świadczy o posiadaniu tej właściwości (fot. 5).

 

 

Fot. 5. Molekularna analiza potencjalnej zdolności tworzenia eniatyn przez F. sambucinum

 

 

Patogeniczność i zawartość mykotoksyn z grupy trichotecenów w ziemniakach inokulowanych F. sambucinum i F. solani

 

Badając patogeniczność F. sambucinum i F. solani stwierdzono znaczne różnice w wielkości zgnilizny powodowanej przez te gatunki (30 dni po inokulacji) (fot. 6).

Ponadto izolaty w obrębie tego samego gatunku (F. sambucinum) wykazywały zróżnicowaną patogeniczność. Stężenie mykotoksyn nie zależało od wielkości zgniłej tkanki bulw ziemniaka. Izolat FSA-05-34, który spowodował najsilniejsze objawy chorobowe, wytworzył niewielką ilość mykotoksyn. Nie wykryto trichotecenów grupy B: NIV, DON i jego pochodnych (3-acetylo-DON, 15-acetylo-DON) oraz z grupy A: toksyna T-2 toksyna HT-2 (fot.7 i tab. 1).

 

 

 

Fot. 6. Porównanie objawów chorobowych na badanych bulwach po 30 dniach od inokulacji

 

 

       FSA-05-34                           FSA-05-42                           FSA-06-31

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Fot. 7. Zróżnicowana patogeniczność izolatów F. sambucinum

 

          Tab. 1. Stężenie mykotoksyn [ppb] w bulwach ziemniaka inokulowanych
izolatami F. sambucinum

Toksyna/ Izolat

FSA-05-34

FSA-05-42

FSA-06-31

MAS

monoacetoksyscirpenol

382,0

6404,0

1146,0

DAS

diacetoksyscirpenol

  14,8

  427,0

    10,6

 

 

Wnioski

1.      System ekologiczny sprzyjał rozwojowi grzybów patogenicznych we wszystkich badanych frakcjach środowiska glebowego ziemniaka.

2.      Więcej objawów zgnilizny kiełków (R. solani) wystąpiło w systemie ekologicznym.

3.      Analiza składu grzybów środowiska glebowego jak i nasilenie występowania rizoktoniozy ziemniaka (R. solani) wskazują, że w systemie ekologicznym nie wytworzyły się zbiorowiska grzybów mogących skutecznie ograniczać czynniki chorobotwórcze.

4.      W badaniach biologii i właściwości grzybów konieczne jest potwierdzenie identyfikacji metodami molekularnymi. Przy znacznym podobieństwie grzybów w obrębie rodzajów, korzystanie wyłącznie z metod tradycyjnych, może prowadzić do błędnych wyników i wniosków.

5.      F. sambucinum posiada potencjalną zdolność produkcji trichotecenów. Wszystkie badane metodą PCR izolaty posiadały gen Tri5, warunkujący ich syntezę.

6.      Badane izolaty F. sambucinum nie posiadały potencjalnej zdolności do syntezy trichotecenów z grupy B (DON i NIV).

7.      Większość badanych izolatów F. sambucinum (ok. 90%) wykazały potencjalną zdolność do syntezy mykotoksyn z grupy eniatyn.

8.      Ziemniaki nawet z lekkimi objawami suchej zgnilizny bulw nie powinny być przeznaczane na paszę dla zwierząt. Mogą w nich występować toksyny fuzaryjne. Stężenie toksyn nie zawsze zależy od wielkości objawów chorobowych.